ИФА-ЦМВ-IgG Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к цитомегаловирусу
Регистрационное удостоверение №ФСР 2008/03911 от «27» февраля 2014 г.
НАЗНАЧЕНИЕ
Выявление и определение титра видоспецифических иммуноглобулинов класса G к цитомегаловирусу (ЦМВ) в сыворотке (плазме) крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе при «ручной» постановке и с использованием ИФА-анализаторов.
СОСТАВ И КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА
Иммуносорбент | нативный инактивированный очищенный антиген цитомегаловируса (ЦМВ), сорбированный на 96-луночном разборном полистироловом планшете для иммунологических реакций с плоским дном (используются «ломающиеся» стрипы) | 1 планшет |
допускается раздельная упаковка стрипов (по 1-4 стрипа в пакете) | ||
Контрольный положительный образец (К+) | инактивированный; содержит иммуноглобулины класса G к ЦМВ в титре 1:1000 или 2,0 PE/мл2 прозрачная красного цвета жидкость | 1 фл.
(1,2 мл) |
Контрольный образец уровня среза (К+пор) | инактивированный; содержит иммуноглобулины класса G к ЦМВ в «пороговом» титре (1:100 или 0,2 PE/мл2); прозрачная желтого цвета жидкость | 1 фл.
(1,2 мл) |
Контрольный отрицательный образец (К–) | инактивированный; прозрачная зеленого цвета жидкость | 1 фл.
(1,2 мл) |
Конъюгат | антитела моноклональные мышиные против иммуноглобулинов человека класса G, меченые пероксидазой хрена; прозрачная розового цвета жидкость | 1 фл.
(13 мл) |
Раствор для разведения образцов (РРО) | прозрачная жидкость синего цвета | 1 фл.
(15 мл) |
Раствор для предвари-тельного разведения образцов (РПРО) | прозрачная жидкость розового цвета | 1 фл.
( 15 мл) |
25-кратный концентрат фосфатно-солевого буферного раствора с твином [ФСБ-Т(х25)] | прозрачная или слегка опалесцирующая бесцветная пенящаяся жидкость, возможно выпадение осадка солей белого цвета, растворяющегося при температуре 37 0С в течение 30 мин.
|
1 фл.
(80 мл) или 2 фл. (по 40 мл) |
Раствор индикаторный (РИ); | прозрачная бесцветная жидкость
|
1 фл.
(13 мл) |
Стоп-реагент | прозрачная бесцветная жидкость | 1 фл.
(12,5 мл) |
Примечания. 1. Набор включает все реагенты, необходимые для постановки ИФА, кроме очищенной (дистиллированной или деионизированной) воды.
- ФСБ-Т(х25), РИ, РРО, РПРО, стоп-реагент – унифицированы для всех наборов ЗАО «ЭКОлаб», в которых используются указанные реагенты.
Набор может быть дополнительно укомплектован:
вспомогательным планшетом для предварительного разведения образцов (1 шт.),
вспомогательными пластиковыми емкостями (4 шт.),
одноразовыми наконечниками для автоматических пипеток (16 шт.)
клейкой пленкой для планшетов (4 шт.).
Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению и бланк калибровочного графика.
По желанию потребителя базовая комплектация набора (число индивидуальных упаковок с реагентами и их объемы) может быть изменена.
ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Базовый вариант комплектации набора позволяет одномоментное исследование 96 образцов, включая контрольные (на контрольные образцы используется 6 лунок, одна лунка – для определения уровня «бланк»). Предусмотрена возможность проведения раздельных исследований с использованием необходимого количества стрипов:
Число стрипов | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
Число иссл. обр. | 1 | 2-9 | 10-17 | 18-25 | 26-33 | 34-41 | 42-49 | 50-57 | 58-65 | 66-73 | 74-81 | 82-89 |
ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
При наличии в исследуемом образце иммуноглобулинов класса G к ЦМВ происходит связывание их с антигенами ЦМВ, сорбированными в лунках планшета-иммуносорбента, образовавшийся комплекс антиген-антитело реагирует с внесенным в реакционную среду раствором конъюгата – антителами к IgG человека, меченными пероскидазой. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело-конъюгат» выявляется в реакции с субстратно-индикаторным раствором, содержащим хромоген – тетраметилбензидин, в результате которой меняется цвет (оптическая плотность) реакционной смеси в лунке планшета; изменение регистрируется спектрофотометрически.
ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Нативная сыворотка (плазма) крови человека объемом не менее 10 мкл.
Образцы сыворотки (плазмы) крови до исследования можно хранить не более 7 сут при температуре от 2 до 8 оС и 3 мес при температуре минус 20 оС или более низкой. Допускается только однократное замораживание-размораживание образцов. Размороженные образцы перед исследованием тщательно перемешать.
Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием липидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.
Образцы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15 мин при 2500-3000 об/мин.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность при проверке на сыворотках стандартизованной панели предприятия или на аналогичных коммерческих панелях, разрешенных к использованию в РФ, – 100 %.
Набор рассчитан на определение содержания IgG к ЦМВ в диапазоне титров от 1:100 до 1:1000 (от 0,2 РЕ/мл до 2,0 РЕ/мл).
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Набор биологически безопасен, однако с исследуемыми образцами необходимо обращаться как с потенциально инфицированным материалом.
Стоп-реагент при попадании на незащищенную кожу и слизистые может вызывать химические ожоги. В случае попадания на кожу – немедленно промойте пораженный участок водой.
СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
Оборудование и материалы (для «ручной» постановки)
Дозаторы пипеточные (пипетки полуавтоматические одно- и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более 5 % с наконечниками полипропиленовыми одноразовыми.
Ручные, или автоматические промыватели, или восьми- и двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.
Спектрофотометр вертикального сканирования для измерения оптической плотности в лунках планшета при 450 нм и/или в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-650 нм.
Центрифуга лабораторная на 2,5-3,0 тыс. об/мин, термостат на 37 оС, холодильник бытовой, фильтровальная бумага.
Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).
70 %-ный раствор спирта этилового и 6 %-ный раствор перекиси водорода (дез.растворы) или растворы иных дезинфектантов, разрешенных к применению СП 1.32322-08, кроме хлорсодержащих.
Приготовление рабочих растворов реагентов для ИФА
Перед работой извлечь набор из холодильника, вскрыть упаковку и выдержать все реагенты перед проведением анализа не менее 30 мин при температуре от 18 до 25 оС.
Предварительное разведение исследуемых образцов
Исследуемые образцы развести 1:10 во вспомогательном планшете, для чего внести в его лунки по 90 мкл РПРО, затем внести в них по 10 мкл сыворотки, тщательно перемешать пипетированием. При этом розовый цвет должен измениться на желтый. Если изменение цвета не произошло, данный образец необходимо исследовать повторно с целью исключения неправильных результатов. Рабочее разведение (1:100) готовить непосредственно в лунках иммуносорбента (см. раздел Проведение ИФА («ручная» постановка), п. 2).
Рабочие разведения образцов хранить не более 6 ч при температуре от 18 до
25 оС.
Приготовление рабочего промывочного раствора (ФСБ-Т)
При выпадении осадка солей в ФСБ-Т(х25) прогреть его при температуре 37 оС до полного растворения осадка.
При постановках с использованием ИФА-анализаторов 80 мл ФСБ-Т(х25) довести водой очищенной до 2 л.
При дробной «ручной» постановке использовать соотношения объемов ФСБ-Т(х25) и воды, указанные в табл. 1 для разного числа используемых стрипов.
Таблица 1
Число стрипов | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
ФСБ-Т(х25), мл | 7 | 10 | 13 | 17 | 20 | 23 | 27 | 30 | 33 | 37 | 40 |
Вода очищенная, мл | до 175 | до 250 | до 325 | до 425 | до 500 | до 575 | до 675 | до 750 | до 825 | до 925 | до 1000 |
Готовый рабочий промывочный раствор хранить при температуре от 2 до 8 ºС не более 14 сут.
Приготовление остальных реагентов
Иммуносорбент, К+, К–, К+пор, РРО, РПРО, конъюгат, РИ, стоп-реагент – готовы к применению.
После вскрытия упаковок неиспользованные реагенты допускается хранить в плотно закрытых упаковках при температуре от 2 до 8 оС до истечения срока годности.
Проведение ИФА («ручная» постановка)
Внимание! Соблюдение указанных ниже температуры и времени инкубации планшетов на каждой стадии постановки крайне важно для получения достоверных результатов.
- Извлечь из упаковки рамку планшета и необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы допускается хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре от 2 до 8 оС до истечения срока годности.
- В лунку А1 внести 100 мкл РРО, в следующие лунки внести по 100 мкл контрольных образцов (по 2 лунки на образец), оставшиеся лунки использовать для исследуемых образцов (по 1 лунке на образец), для чего внести в них: вначале по 90 мкл РРО, а затем – по 10 мкл образцов, предварительно разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета (см. раздел «Предварительное разведение исследуемых образцов»), тщательно перемешать пипетированием.
- Инкубировать планшет 30 мин при температуре от 21 до 250С в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить содержимое лунок, 4 раза промыть планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме «Overflow», использовать именно этот режим. По окончании промывки остатки раствора удалить из лунок, постукивая перевернутым планшетом по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
- Во все лунки планшета внести по 100 мкл конъюгата.
- Планшет закрыть крышкой или клейкой пленкой, инкубировать 30 мин при температуре от 21 до 250С в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить содержимое лунок, 4 раза промыть планшет как указано в п. 4.
- Во все лунки внести по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно поместить планшет в защищенное от света место и инкубировать 10–15 мин при температуре от 21 до 250С.
- Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился субстратно-индикаторный раствор) внести по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешать содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступить к учету результатов.
Регистрация и учет результатов
Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически, выводя спектрофотометр на нулевой уровень («бланк») по лунке А1 и измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн – 450 нм и 620-650 нм. При отсутствии референс-фильтра на 620-650 нм оптическую плотность (ОП) измерять при длине волны 450 нм.
Результаты ИФА учитывать при следующих условиях:
среднее значение ОПК+ – не менее 0,60;
среднее значение ОПК+пор – не менее 0,20;
отношение среднего значения ОПК+ к среднему значению ОПК+пор – не менее 1,5;
среднее значение ОПК– – не более 0,10.
В противном случае исследование необходимо повторить.
Качественный учет результатов
Исследуемые образцы учитывать:
как положительные при ОПобр выше 1,1хОПК+пор,
как отрицательные при ОПобр ниже 0,9хОПК+пор.
Образцы с ОП в пределах от 0,9хОПК+пор до 1,1хОПК+пор, т.е. в так называемой «серой» зоне, рекомендуется исследовать повторно, поскольку результаты, полученные в ней, не могут быть однозначно интерпретированы. При повторном получении указанного результата, образцы считают отрицательными.
Определение титра антител (или их содержания в РЕ/мл)
Для определения титра антител класса G к ЦМВ (или их содержания в РЕ/мл) на стандартном бланке (входит в состав набора) строится калибровочный график. Для этого по оси абцисс (логарифмическая шкала) откладываются значения титров К+ (1:1000) и К+пор (1:100) или соответствующее им содержание антител в РЕ/мл (2,0 РЕ/мл и 0,2 РЕ/мл, соответственно), а по оси ординат (пропорциональная шкала) – средние значения ОП в лунках с этими образцами, полученные в ИФА. Полученные точки соединяются прямой линией. Титр антител в исследуемых образцах (или их содержание в РЕ/мл) определяется по калибровочному графику как абсцисса точки, ордината которой равна полученному в ИФА значению ОП.
Если ОПобразца превышает ОПК+, для более точного определения титра рекомендуется при повторном анализе развести данный образец дополнительно в 10 раз (конечное разведение 1:1000). Повторить анализ и полученное по графику значение титра (или РЕ/мл) увеличить в 10 раз.
ПОСТАНОВКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА-АНАЛИЗАТОРОВ
Подготовить прибор в соответствии с инструкцией по его эксплуатации, ввести программу анализа, соответствующую используемому набору, и провести анализ.
СРОК ГОДНОСТИ
Срок годности набора – 1 год. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.
ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ
Хранение
В упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2 оС до 8 оС. Замораживание не допускается.
Транспортирование
При температуре от 2 оС до 8 оС. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9 оС до 25 оС в течение 10 сут.
УСЛОВИЯ ОТПУСКА
Для учреждений здравоохранения.
По вопросам, касающимся качества набора, следует обращаться по адресу 142530 Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1, ЗАО «ЭКОлаб»; тел. (49643) 3-23-11, факс (49643) 3-30-93 – отдел сбыта, (49643) 3-37-30 – ОБТК и в учреждение, уполномоченное Росздравнадзором на проведение государственного контроля качества указанной продукции.
КРАТКАЯ СХЕМА ИФА
(ИФА-ЦМВ-IgG)
Использовать только после тщательного ознакомления с инструкцией! | |
Внести | в лунку А1– 100 мкл РРО,
в лунки B1, С1-. по 100 мкл К+, в лунки D1, E1-по 100 мкл К+пор в лунки F1,G1 –по 100 мкл К-, в остальные лунки – вначале по 90 мкл РРО, а затем – по 10 мкл образцов, предварительно разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета (см. раздел «Предварительное разведение исследуемых образцов») |
Инкубация | 30 мин, 21-25 оС |
Промыть | 4 раза промывочным раствором |
Внести | по 100 мкл конъюгата в каждую лунку |
Инкубация | 30 мин, 21-25 оС |
Промыть | 4 раза промывочным раствором |
Внести | по 100 мкл индикаторного раствора в каждую лунку |
Инкубация | 10-15 мин, 21-25 оС |
Внести | по 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку |
Измерить | ОП при 450 нм (референс 620-650 нм), «бланк» — по лунке А1 |
Взамен инструкции, утвержденной 07.07.2005 г, № 01-011/123-05.
РЕ/мл – единицы содержания IgG к ЦМВ (единицы института Пауля Эрлиха), принятые ВОЗ.