ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов
Набор реагентов для выявления антител класса IgМ к Mycoplasma pneumoniae методом иммуноферментного анализа ИФА-Мико-пневмо-IgM
Регистрационное удостоверение ФСР 2007/00330 от 23 января 2014 года
НАЗНАЧЕНИЕ
Выявление видоспецифических антител класса IgМ к Mycoplasma pneumoniae в сыворотке (плазме) крови людей методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) на твердофазном носителе при «ручной» постановке и с использованием ИФА-анализаторов.
СОСТАВ И КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА
Иммуносорбент | лизатный инактивированный очищенный антиген Mycoplasma pneumoniae, сорбированный на 96-луночном разборном полистироловом планшете для иммунологических реакций с плоским дном (используются «ломающиеся» стрипы) | 1 планшет |
допускается раздельная упаковка стрипов (по 1-4 стрипа в пакете) | ||
Контрольный положительный образец (К+) | инактивированный; прозрачная жидкость красного цвета | 1 фл.(1,2 мл) |
Контрольный образец уровня среза (К+пор) | инактивированный; прозрачная жидкость желтого цвета | 1 фл.(1,2 мл) |
Контрольный отрицательный образец (К–) | инактивированный; прозрачная жидкость зеленого цвета | 1 фл.(1,2 мл) |
Конъюгат | антитела диагностические мышиные против иммуноглобулинов человека класса IgM, меченые пероксидазой; прозрачная жидкость розового цвета | 1 фл.(13 мл) |
Раствор для разведения образцов (РРО) | прозрачная жидкость синего цвета | 1 фл.(60 мл)или 2 фл.(по 30 мл) |
Блокирующий раствор (БР) | прозрачная бесцветная жидкость | 1 фл.(7,5 мл) |
25-кратный концентрат промывочного раствора [ПР(х25)] | прозрачная или слегка опалесцирующая бесцветная пенящаяся жидкость, возможно выпадение осадка солей белого цвета, растворяющегося при температуре 37 0С в течение 30 мин | 1 фл.(80 мл)или 2 фл.(по 40 мл) |
Раствор индикаторный (РИ); | прозрачная бесцветная жидкость | 1 фл.(13 мл) |
Стоп-реагент | прозрачная бесцветная жидкость. | 1 фл.(12,5 мл) |
Примечания. 1. Набор включает все реагенты, необходимые для постановки ИФА, кроме очищенной (дистиллированной или деионизированной) воды.
- ПР(х25), РИ, РРО, стоп-реагент – унифицированы для всех наборов ЗАО «ЭКОлаб», в которых используются указанные реагенты.
Набор может быть дополнительно укомплектован:
вспомогательными пластиковыми емкостями (4 шт.),
одноразовыми наконечниками для автоматических пипеток (16 шт.),
клейкой пленкой для планшетов (4 шт.).
Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению.
По желанию потребителя базовая комплектация набора (число индивидуальных упаковок с реагентами и их объемы) может быть изменена.
ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Базовый вариант комплектации набора позволяет одномоментное исследование 96 образцов, включая контрольные (на контрольные образцы используется 6 лунок и 1 лунка – для выведения уровня «бланк» спектрофотометра). Предусмотрена возможность проведения раздельных исследований с использованием необходимого количества стрипов:
Число стрипов | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
Число иссл. обр. | 1 | 2-9 | 10-17 | 18-25 | 26-33 | 34-41 | 42-49 | 50-57 | 58-65 | 66-73 | 74-81 | 82-89 |
ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ
При наличии в исследуемом образце антител класса IgМ к Mycoplasma pneumoniae они связываются с антигеном, сорбированным на поверхности лунок полистиролового планшета, этот комплекс, в свою очередь, связывается с конъюгатом – антителами против IgM человека, мечеными пероксидазой хрена. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело-конъюгат» выявляется по реакции с субстратом пероксидазы – тетраметилбензидином, в результате которой бесцветное содержимое лунок приобретает голубой цвет, изменение цвета регистрируется по оптической плотности раствора в лунке планшета с помощью спектрофотометра.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Диагностическая чувствительность набора при определении на сыворотках стандартной панели предприятия, содержащих антитела класса IgM к Mycoplasma pneumoniae – 100 %.
Диагностическая специфичность набора при определении на сыворотках стандартной панели предприятия, не содержащих антитела класса IgM к Mycoplasma
pneumoniae – 100 %.
ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ
Сыворотка (плазма) крови человека объемом не менее 10 мкл.
Образцы до исследования можно хранить не более 7 сут при температуре от 2 до 8 оС или до 3 мес при температуре минус 20 оС или более низкой. Допускается только однократное замораживание-размораживание образцов. Размороженные образцы перед исследованием тщательно перемешать.
Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием липидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.
Образцы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15 мин при 2500-3000 об/мин.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Набор биологически безопасен, однако с исследуемыми образцами необходимо обращаться как с потенциально инфицированным материалом.
Стоп-реагент при попадании на незащищенную кожу и слизистые может вызывать химические ожоги. В случае попадания на кожу – немедленно промойте пораженный участок водой.
Утилизацию или уничтожение, дезинфекцию наборов реагентов следует проводить в соответствии с СанПин 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к об-ращению с медицинскими отходами» и МУ-287-113 «Методические указания по дезинфек-ции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения».
СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ
Оборудование и материалы (для «ручной» постановки)
Дозаторы пипеточные (пипетки полуавтоматические одно- и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более 5 % с наконечниками полипропиленовыми одноразовыми.
Ручные, или автоматические промыватели, или восьми- и двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.
Спектрофотометр вертикального сканирования для измерения оптической плотности в лунках планшета при 450 нм и/или в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-650 нм.
Центрифуга лабораторная на 2,5-3,0 тыс. об/мин, термостат на 37 оС, холодильник бытовой, фильтровальная бумага.
Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).
70 %-ный раствор спирта этилового и 6 %-ный раствор перекиси водорода (дез.растворы) или растворы иных дезинфектантов, разрешенных к применению СП 1.32322-08, кроме хлорсодержащих.
Приготовление рабочих растворов реагентов для ИФА
Перед работой извлечь набор из холодильника, вскрыть упаковку и выдержать все реагенты перед проведением анализа не менее 30 мин при температуре от 18 до 25 оС.
Приготовление рабочих разведений исследуемых образцов
По 10 мкл каждого образца смешать с 0,5 мл РРО. 0,075 мл полученного разведения смешать с 0,075 мл БР (разведение 1:100), тщательно перемешать
пипетированием, выдержать 30 мин при температуре от 18 до 25 оС.
Приготовление рабочего промывочного раствора (ПР)
При выпадении осадка солей в ПР(х25) прогреть его при температуре 37 оС до полного растворения осадка.
При постановках с использованием ИФА-анализаторов 80 мл ПР(х25) довести водой очищенной до 2 л.
При дробной «ручной» постановке использовать соотношения объемов ПР(х25) и воды, указанные в табл. 1 для разного числа используемых стрипов.
Таблица 1
Число стрипов | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
ПР(х25), мл | 7 | 10 | 13 | 17 | 20 | 23 | 27 | 30 | 33 | 37 | 40 |
Вода очищенная, мл | до 175 | до 250 | до 325 | до 425 | до 500 | до 575 | до 675 | до 750 | до 825 | до 925 | до 1000 |
Готовый рабочий промывочный раствор хранить при температуре от 2 до 8 ºС не более 14 сут.
Приготовление остальных реагентов
Иммуносорбент, К–, К+, К+пор, РРО, БР, конъюгат, РИ, стоп-реагент – готовы к применению. После вскрытия упаковок неиспользованные реагенты допускается хранить в плотно закрытых упаковках при температуре от 2 до 8 оС до истечения срока годности.
7.2. Проведение анализа («ручная» постановка)
Внимание! Соблюдение указанных ниже температуры и времени инкубации планшетов на каждой стадии постановки крайне важно для получения достоверных результатов.
- Извлечь из упаковки рамку планшета и необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы допускается хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре от 2 до 8 оС до истечения срока годности.
- Внести (соблюдая указанную последовательность):
в одну лунку (например, А1) — 100 мкл РРО;
в две лунки (например, B1, C1) – по 100 мкл К+,
в две лунки (например, D1, E1) – по 100 мкл К+пор,
в две лунки (например, F1, G1) – по 100 мкл К–,
в следующие лунки – по 100 мкл подготовленных исследуемых образцов (по 1 лунке на образец).
- Планшет закрыть крышкой или клейкой пленкой. Инкубировать 30 мин при температуре от 21 до 25оС в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить жидкость из лунок, 4 раза промыть планшет ПР, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При ручной отмывке внесенный в лунки ПР необходимо выдерживать не менее 30 с. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме «Overflow», использовать именно этот режим. По окончании промывки остатки раствора удалить из лунок, постукивая перевернутым планшетом по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
- Во все лунки внести по 100 мкл конъюгата.
- Планшет закрыть крышкой или клейкой пленкой. Инкубировать 30 мин при температуре от 21 до 25оС в защищенном от света месте.
- С помощью промывателя удалить жидкость из лунок, 4 раза промыть планшет ПР, как указано в п. 4.
- Во все лунки внести по 100 мкл РИ, немедленно поместить планшет в защищенное от света место и инкубировать 10 мин при температуре от 21 до 25оС.
- Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился индикаторный раствор) внести по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешать содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступить к учету результатов.
Регистрация и учет результатов
Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн – 450 нм и 620-650 нм. При отсутствии референс-фильтра на 620-650 нм оптическую плотность (ОП) измерять при длине волны 450 нм, а выведение спектрофотометра на нулевой уровень («бланк») осуществлять по лунке А1.
Результаты ИФА учитывать при следующих условиях:
среднее значение ОП в лунках с К+ не менее 0,6;
среднее значение ОП в лунках с К+пор не менее 0,2;
среднее значение ОП в лунках с К– не более 0,15.
В противном случае исследование необходимо повторить.
Исследуемые образцы учитываются:
как положительные при ОП выше 1,1х(ОПК+пор),
как отрицательные при ОП ниже 0,9х(ОПК+пор).
При ОП исследуемого образца, лежащей в диапазоне от 0,9х(ОПК+пор) до 1,1х(ОПК+пор), образцы должны быть исследованы повторно. При повторном получении таких результатов рекомендуется мониторинг иммунного статуса пациента для исключения неспецифических, в том числе перекрестных реакций, приводящих к сомнительным результатам.
ПОСТАНОВКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА-АНАЛИЗАТОРОВ
Подготовить прибор в соответствии с инструкцией по его эксплуатации, ввести программу анализа, соответствующую используемому набору, и провести анализ.
СРОК ГОДНОСТИ
Срок годности набора – 1 год. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.
ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ
Хранение — в упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2 до 8 оС. Замораживание не допускается.
Транспортирование — при температуре от 2 до 8 оС. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 оС в течение 10 сут.
УСЛОВИЯ ОТПУСКА
Для учреждений здравоохранения.
По вопросам, касающимся качества набора, следует обращаться по адресу 142530 Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1. ЗАО «ЭКОлаб»; тел. (49643) 3-23-11, факс (49643) 3-30-93 – отдел сбыта, (49643) 3-37-30 – ОБТК.
КРАТКАЯ СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИФА
(«ИФА-Мико-пневмо-IgM«)
Использовать только после тщательного ознакомления с инструкцией! | |
Внести | в лунку А1 – 100 мкл РРО;в лунки B1, C1 – по 100 мкл К+,в лунки D1, E1 – по 100 мкл К+пор,в лунки F1, G1 – по 100 мкл К—,в следующие лунки — по 100 мкл подготовленных исследуемых образцов (по 1 лунке на образец) |
Инкубация | 30 мин, 21-25 оС |
Промыть | 4 раза промывочным раствором |
Внести | по 100 мкл конъюгата в каждую лунку |
Инкубация | 30 мин, 21-25 оС |
Промыть | 4 раза промывочным раствором |
Внести | по 100 мкл индикаторного раствора в каждую лунку |
Инкубация | 10 — 15 мин, 21-25 оС |
Внести | по 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку |
Измерить | ОП при 450 нм (референс 620-650 нм),«бланк» — по лунке А1 |