ИФА-Хеликобактер-IgA

ИФА-Хеликобактер-IgA. № ФСР 2010/08509 от 03.08.2010
Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса А к Helicobacter pylori

ИНСТРУКЦИЯ по применению набора реагентов «ИФА-Хеликобактер IgA»

Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса А к Helicobacter pylori

 Регистрационное удостоверение №ФСР 2010/08509 от «03» августа 2010 г.

НАЗНАЧЕНИЕ

Выявление и определение титра видоспецифических иммуноглобулинов класса А к Helicobacter pylori в сыворотке (плазме) крови людей методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА) при «ручной» постановке и с использованием ИФА-анализаторов.

СОСТАВ И КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА

Примечания. 1. Набор включает все реагенты, необходимые для постановки ИФА, кроме очищенной (дистиллированной или деионизированной) воды.

2. ФСБ-Т(х25), РИ, РРО, стоп-реагент – унифицированы для всех наборов ЗАО «ЭКОлаб», в которых используются указанные реагенты.

Набор может быть дополнительно укомплектован:

вспомогательными пластиковыми емкостями (4 шт.),

планшетом для предварительного разведения образцов (1 шт.),

одноразовыми наконечниками для автоматических пипеток (16 шт.),

клейкой пленкой для планшетов (4 шт.).

Компоненты набора упакованы в коробку, в коробку вложена инструкция по применению и бланк калибровочного графика.

По желанию потребителя базовая комплектация набора (число индивидуальных упаковок с реагентами и их объемы) может быть изменена

ОСНОВНЫЕ ПОТРЕБИТЕЛЬСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Базовый вариант комплектации позволяет одномоментное исследование 96 образцов, включая контрольные (на контрольные образцы используется 6 лунок, одна лунка используется для контроля уровня «бланк»). Предусмотрена возможность проведения раздельных исследований с использованием необходимого количества стрипов:

ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ

При наличии в исследуемом образце антител класса А к Helicobacter pylori, они связываются с антигеном, сорбированным на поверхности лунок полистиролового планшета; этот комплекс, в свою очередь, связывается с конъюгатом – антителами против IgA человека, мечеными пероксидазой хрена. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело-конъюгат» выявляется в реакции с индикаторным раствором, содержащим хромоген – тетраметилбензидин, в результате которой меняется цвет (оптическая плотность) реакционной смеси в лунке планшета; изменение регистрируется спектрофотометрически.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

Аналитическая чувствительность (минимальный определяемый титр иммуноглобулинов класса А к Helicobacter pylori) – не более 1:45.

Коэффициент вариации ОП контрольных образцов – не более 8 %.

ИССЛЕДУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ

Нативная сыворотка (плазма) крови человека объемом не менее 100 мкл.

Образцы сыворотки (плазмы) крови до исследования можно хранить не более 7 сут при температуре от 2 до 8 ^оС и 3 мес при температуре минус 20 ^оС или более низкой. Допускается только однократное замораживание-размораживание образцов. Размороженные образцы перед исследованием тщательно перемешать.

Не допускается использование для исследования образцов с повышенным содержанием липидов и (или) с признаками гемолиза, и (или) с видимым микробным проростом.

Образцы, содержащие осадок, перед анализом отцентрифугировать в течение 10-15 мин при 2500-3000 об/мин.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Набор биологически безопасен, однако с исследуемыми образцами необходимо обращаться как с потенциально инфицированным материалом.

Стоп-реагент при попадании на незащищенную кожу и слизистые может вызывать химические ожоги. В случае попадания на кожу – немедленно промойте пораженный участок водой.

СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ

Оборудование и материалы (для «ручной» постановки)

Дозаторы пипеточные (пипетки полуавтоматические одно- и многоканальные переменного объема) для внесения реагентов в лунки планшета с погрешностью дозирования не более 5 % с наконечниками полипропиленовыми одноразовыми.

Ручные, или автоматические промыватели, или восьми- и двенадцатиканальные пипеточные дозаторы для промывания лунок планшета.

Спектрофотометр вертикального сканирования для измерения оптической плотности в лунках планшета при 450 нм и/или в двухволновом режиме при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620-650 нм.

Центрифуга лабораторная на 2,5-3,0 тыс. об/мин, термостат на 37 ^оС, холодильник бытовой, фильтровальная бумага.

Вода очищенная (дистиллированная или деионизированная).

70 %-ный раствор спирта этилового и 6 %-ный раствор перекиси водорода (дез.растворы) или растворы иных дезинфектантов, разрешенных к применению СП 1.32322-08, кроме хлорсодержащих.

Приготовление рабочих  растворов реагентов для ИФА

Перед работой извлечь набор из холодильника, вскрыть упаковку и выдержать все реагенты перед проведением анализа не менее 30 мин при температуре  от 18 до 25 ^оС.

Подготовка исследуемых образцов.

Возможны два способа приготовления рабочих разведений:

1 способ

По 10 мкл каждого образца смешать с 1 мл РРО (разведение 1:100), тщательно перемешать пипетированием.

2 способ

Образцы вначале развести 1:10 во вспомогательном планшете, для чего внести в его лунки по 90 мкл РРО, затем внести в них по 10 мкл исследуемых образцов, тщательно перемешать пипетированием. Рабочее разведение (1:100) готовить непосредственно в лунках иммуносорбента (см. раздел Проведение ИФА («ручная» постановка), п. 2)

Рабочие разведения образцов хранить не более 6 ч при температуре  от 18 до
25 ^оС.

Приготовление рабочего промывочного раствора  (ФСБ-Т)

При выпадении осадка солей в ФСБ-Т(х25) прогреть его при температуре  37 ^оС до  полного растворения осадка.

При постановках с использованием ИФА-анализаторов 80 мл  ФСБ-Т(х25) довести водой очищенной до 2 л.

При дробной «ручной» постановке использовать соотношения объемов ФСБ-Т(х25) и воды, указанные в табл. 1 для разного числа используемых стрипов.

Таблица 1

Готовый рабочий промывочный раствор хранить при температуре от 2 до 8 ºС не более 14 сут.

Приготовление остальных реагентов

Иммуносорбент, контрольные образцы, РРО, конъюгат, РИ, стоп-реагент – готовы к применению.

После вскрытия упаковок неиспользованные реагенты допускается хранить в плотно закрытых упаковках при температуре от 2 до 8 ^оС до истечения срока годности

Проведение ИФА

Внимание! Соблюдение указанных ниже температуры и времени инкубации планшетов на каждой стадии постановки крайне важно для получения достоверных результатов.

1. Извлечь из упаковки рамку планшета и необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы допускается хранить в плотно закрытом пакете с влагопоглотителем при температуре от 2 до 8 ^оС до истечения срока годности.
2. В лунку А1 внести 100 мкл РРО, в следующие лунки внести по 100 мкл контрольных образцов (по 2 лунки на образец), оставшиеся лунки использовать для исследуемых образцов (по 1 лунке на образец), для чего внести в них:

при первом способе приготовления рабочих разведений исследуемых образцов – по 100 мкл готовых разведений;

при втором способе приготовления рабочих разведений исследуемых образцов – вначале по 90 мкл РРО, а затем – по 10 мкл образцов, предварительно разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета, тщательно перемешать пипетированием.

3. Планшет закрыть крышкой или клейкой пленкой. Инкубировать 30 мин при температуре от 21 до 25 ^оС в защищенном от света месте.
4. С помощью промывателя удалить образцы из лунок, 4 раза промыть планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме «Overflow», использовать именно этот режим. По окончании промывки остатки раствора удалить из лунок, постукивая перевернутым планшетом по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге
5. Во все лунки внести по 100 мкл конъюгата. Планшет закрыть крышкой или клейкой пленкой. Инкубировать 30 мин при температуре от 21 до 25 ^оС в защищенном от света месте.
6. С помощью промывателя удалить жидкость из лунок, 4 раза промыть планшет, как указано выше.
7. Во все лунки внести по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно поместить планшет в защищенное от света место и инкубировать 10 мин при температуре от 21 до 25^оС.
8. Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился субстратно-индикаторный раствор) внести по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешать содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступить к учету результатов.

Регистрация и учет результатов

Результаты ИФА регистрировать спектрофотометрически, выводя спектрофотометр на нулевой уровень («бланк») по лунке А1 и измеряя оптическую плотность (ОП) при двух длинах волн – 450 нм и 620-650 нм. При отсутствии референс-фильтра на 620-650 нм оптическую плотность (ОП) измерять при длине волны 450 нм.

Результаты ИФА учитываются только при следующих условиях:

ОП_бланк – не более 0,1;

среднее значение ОП(К⁺)  – не менее 0,6;

среднее значение ОП(К⁺_пор) – не менее 0,25;

среднее значение ОП(К^–) – не более 0,15,

отношение среднего значения ОП(К⁺) к среднему значению ОП(К⁺_пор) — не менее 1,5; в противном случае исследование необходимо повторить.

Учет результатов качественного определения

Исследуемые образцы учитывать как положительные при ОП_обр больше
1,1× ОП(К⁺_пор).

Исследуемые образцы учитывать как отрицательные при ОП_обр меньше
0,9 ×ОП(К⁺_пор)

Исследуемые образцы учитывать как сомнительные при ОП_обр в диапазоне от
0,9× ОП(К⁺_пор) до 1,1× ОП(К⁺_пор).

Образцы, оцененные как сомнительные, должны быть исследованы повторно. При повторном получении сомнительных результатов рекомендуется мониторинг иммунного статуса пациента для исключения неспецифических, в том числе перекрестных реакций, приводящих к сомнительным результатам.

Учет результатов полуколичественного определения

Для полуколичественного учета результатов (титр антител класса А к Нelicobacter pylori в исследуемых образцах) построить калибровочную кривую, для чего на стандартном бланке (вкладывается в каждый набор) по оси абсцисс (логарифмическая шкала) отложить значения титров К⁺ и К⁺_пор, указанные в разделе «Состав набора», а по оси ординат (пропорциональная шкала) – соответствующие им средние значения ОП, полученные в ИФА. По полученным точкам провести прямую линию.

Для оценки титра исследуемого образца на калибровочной кривой найти точку, ордината которой равна значению ОП, полученному в ИФА с этим образцом; абсцисса этой точки будет равна титру антител класса G в образце.

Если значение ОП испытуемого образца превышает значения ОП(К⁺), его следует протестировать повторно в большем разведении.

ПОСТАНОВКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИФА-АНАЛИЗАТОРОВ

Подготовить прибор в соответствии с инструкцией по его эксплуатации, ввести программу анализа, соответствующую используемому набору, и провести анализ.

Диагностическая значимость и интерпретация результатов

Результаты серологического исследования могут быть использованы для постановки окончательного диагноза только с учетом данных анамнеза и клинической картины. Выявление IgА антител при качественном исследовании требует обязательной оценки их титра и последующего наблюдения его динамики, поскольку только постоянство, нарастание или снижение этого показателя во времени может быть поставлено в соответствие с анамнезом и клинической картиной.

СРОК ГОДНОСТИ

Срок годности набора – 1 год. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.

ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ

Хранение

В упаковке предприятия-изготовителя при температуре от 2 до 8 ^оС. Замораживание не допускается.

Транспортирование

При температуре от 2 до 8 ^оС. Замораживание не допускается. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 ^оС в течение 10 сут.

УСЛОВИЯ ОТПУСКА

Для учреждений здравоохранения.

По вопросам, касающимся качества набора, следует обращаться по адресу 142530 Московская обл., г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1, ЗАО «ЭКОлаб»; тел. (49643) 3-23-11, факс (49643) 3-30-93 – отдел сбыта, (49643) 3-37-30 – ОБТК  и в учреждение, уполномоченное Росздравнадзором на проведение государственного контроля качества указанной продукции.

КРАТКАЯ СХЕМА ПОСТАНОВКИ ИФА

«ИФА-Хеликобактер-IgА»

ИФА-Хеликобактер-IgA